蛋白水解靶向嵌合体PROTAC技术的研究进展

来源：药渡

撰文：香蕉小卢    编辑：丸子

蛋白降解靶向嵌合体技术（PROTAC），是利用异双功能小分子化合物将靶蛋白和细胞内E3连接酶拉近，利用生物体内泛素-蛋白酶体蛋白降解途径特异性降解靶蛋白。PROTAC分子由3部分组成，一端是特异性E3连接酶配体，另一端是靶蛋白的特异性配体，以及中间的连接子，从而组成“靶蛋白-PROTAC-E3连接酶”三元复合物。

自20多年前报道了第一个PROTAC小分子，靶向蛋白降解技术已从学术研究走向工业界，许多生物技术和医药行业已经进行了相关临床前和早期临床项目研究。2019年，第一个PROTAC分子进入了临床试验；2020年，针对两个已确定的癌症靶点：雌激素受体(ER)和雄激素受体(AR)完成了临床概念验证。随后，来自Bristol Myers Squibb (BMS)、Nurix Therapeutics、Kymera Therapeutics、Dialec Therapeutics、Foghorn Therapeutics等公司的降解剂也进入了临床研究。

PROTAC在分子水平上的开发过程如图所示，包括选择靶标，设计合成PROTAC分子，实验验证其降解能力、降解机制、三元复合物的形成、降解选择性、以及最后的药代及药效等。

PROTAC靶向蛋白降解技术在临床上完成了概念验证后，各种衍生的蛋白降解技术纷纷出现，在生物医药领域新的应用场景不断被发掘。首批完成概念临床试验的PROTAC药物靶向成熟靶点，具备成为“best-in-class”药物的潜力。接下来将介绍未来PROTAC的发展方向。

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优化PROTAC分子的理化性质

1997年引入的Role5有助于识别可能具有高口服生物利用度的候选药物（MW≤500，logP≤5，H键供体≤5，H键受体≤10）。随着PROTAC的研究进展，与良好的药代动力学特征相关的理化性质将可以预测。例如：通过搜索Roche化合物库，Cantrill等人发现PROTAC分子符合PSA、MW和AlogP的3D图中的bRo5空间，并且三者都有随时间减少的趋势。此外，即使PROTACs具有多个电离中心，精确的pKa值也可以通过完整的PROTAC分子来测量。并且可以通过色谱法来测量分布系数logD。

渗透率最好通过细胞渗透率测定来确定，因此需要优化培养条件，但目前PAMPA可能不适用于降解剂的渗透性评价。在水介质中，可以利用热力学溶解度实验来测量渗透率。此外，在研究具有环基团的分子时，应充分考虑分子的柔韧性。酰胺-酯取代策略可用于改善类似protac模型化合物的理化性质。目前已经开发了多参数评分函数ABMPS等指标，为这类化合物的设计提供指南(AB-MPS评分越低，吸收的可能性越高)。

目前大多数研究都集中在CRBN靶向分子上，因为IMiDs的分子量较低，氢键供体和受体数量较少，脂溶性较高，符合口服化合物的原则。在AstraZeneca PROTAC分子文库中发现，使用沙利度胺/泊马度胺/来那度胺衍生的CRBN E3连接酶配体的多个PROTAC分子，口服生物利用度(>30%)相对较高。

目前研究人员获得以下结论：1、基于CRBN配体的PROTAC比基于VHL配体的口服利用度更高。2、色谱LogD7.4值在4.5 ~ 6.5之间时可能会获得理想的口服生物利用度。3、口服生物利用度高的PROTACs会违反Ro5的2 ~ 3项。

总体而言，与小分子药物相比，PROTAC的理化性质预测仍处于分散探索阶段，尚未形成明显规律，但未来“PROTAC Role 5”一定会出现并完善。

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计算机辅助设计PROTAC分子

在PROTAC这个快速发展的领域，需要合成大量的类似物来探索结构变化，以鉴定有效的降解剂。在没有大量试验和错误的情况下合理有效地设计PROTACs仍然是一个挑战。目前利用计算机辅助高效设计protac和预测形成的三元配合物的结构已成为趋势。此外，对接模拟和分子动力学已被用于发现最佳连接体长度和理想位置。

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扩大E3连接酶

在PROTAC分子的应用范围

值得注意的是，E3连接酶在PROTAC领域的开发还远远不够，只有一小部分E3连接酶到了利用。有超过600个人类基因组编码的泛素E3连接酶有待探索，虽然基于募集CRBN和VHL连接酶的PROTAC分子设计已经日渐成熟，但它们的临床前和临床期开发仍然面对多重挑战。尤其在肿瘤学领域，对治疗药物的耐药性可以迅速出现，肿瘤可能通过产生基因突变，逃避依赖非必需连接酶（比如CRBN和VHL）的蛋白降解剂作用。这些挑战为开发新的E3连接酶提供了机会。

E3连接酶作为靶蛋白和E2泛素结合酶(E2-ub)之间的支架，通过结合两种分子，然后催化泛素从E2的活性位点半胱氨酸转移到靶蛋白的赖氨酸侧链上。泛素连接酶通过多种机制实现这一催化作用。因此可以根据使用的泛素的连接策略将人类基因组中的E3连接酶分为以下几类。

简单概括一下：最大的一类泛素连接酶是RING连接酶，可以同时与靶蛋白和E2-Ub结合，并将泛素直接转移到靶蛋白的赖氨酸残基上。第二类，HECT连接酶，首先结合靶点，先将泛素转移到自己身上，形成E3-泛素复合物，再将泛素转移到靶点上。第三类：RBR连接酶，是RING和HECT连接策略的结合。

在早期关于激酶可降解性研究的基础上，一项研究揭示了E3连接酶中的可降解的激酶和不同的激酶降解图谱，突显了连接酶选择在靶向降解激酶方面的重要性。不同的连接酶降解活性的差异可以受几个因素影响。一是连接酶的构象和靶点蛋白之间的互补性。二是连接酶与靶点蛋白直接构成可导致降解的三元结构的能力。形成三元复合物是PROTAC分子作用的必要步骤，但三元配合物的形成受底物影响，也就是说，三元复合物如果过于有效地形成并保持紧密结合，就不会导致有效降解。三是连接酶和靶点蛋白的细胞内定位。四是细胞特异性连接酶和靶点的表达。

因此充分利用尚未在PROTACs中使用的E3连接酶，将有利于PROTACs的发展，使其具有更多的治疗优势。

然而，可能出现的诱导肿瘤细胞产生获得性耐药是PROTAC分子的一个局限性。耐药的产生是由于靶蛋白的点突变导致无法形成三元复合物而靶蛋白活性增强。对于耐药性的出现，可以从以下三个方面考虑。(1)应用新的POI配体或新的E3连接酶。含有不同POI配体的PROTAC结合了一个新的POI口袋，可以用来减缓耐药性，例如竞争性和变构抑制剂对BCR-ABL的抑制。(2)双靶向治疗。这种protac包含一个双靶点弹头或两个弹头分别靶向两个靶点。(3)去泛素酶的抑制作用。去泛素酶从靶蛋白中去除泛素，在泛素-蛋白酶体系统介导的蛋白质稳态中发挥重要作用。多项研究表明，去泛素酶在耐药性中起着重要作用。值得注意的是，去泛素酶USP15通过拮抗泛素化防止CRBN介导的底物降解。因此，鉴定和抑制介导PROTACs耐药的去泛素酶也可能是克服癌症耐药和治疗反应的重要方法。

综上，PROTAC技术具有良好的治疗前景，发展潜力巨大。近两年，PROTAC标杆公司Arvinas正处于临床关键阶段，ARV-110和ARV-471的II/III期临床结果会很大程度上影响PROTAC的发展策略。在未来的20年里，PROTAC技术有望在难成药靶点和全新靶点上实现“first-in-class”的突破。

参考文献：

1.Minglei Li, Ying Zhi, Bo Liu, and Qingqiang Yao Journal of Medicinal Chemistry Article ASAP

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2.Yan Li, Jian Song, Ping Zhou, Jun Zhou, and Songbo Xie Journal of Medicinal Chemistry 2022 65 (15), 10183-10194  

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3.Békés, M., Langley, D.R. & Crews, C.M. PROTAC targeted protein degraders: the past is prologue. Nat Rev Drug Discov 21, 181–200 (2022). https://doi.org/10.1038/s41573-021-00371-6

4.Samuel A. Lambert, Arttu Jolma, Laura F. Campitelli, Pratyush K. Das, Yimeng Yin, Mihai Albu, Xiaoting Chen, Jussi Taipale, Timothy R. Hughes, Matthew T. Weirauch, Cell, 172, 4,2018, 650-665,

https://doi.org/10.1016/j.cell.2018.01.029.